0 引言 Introduction
骨骼肌钝挫伤是最常见的肌肉损伤类型之一[1-2]，指发生在组织受到快速而强大的压力，如直接且非穿透性撞击肌腹的情况下，通常会导致肌肉的钝挫伤，进而导致肌肉内血肿[3-4]。这类损伤多发生于足球等团队运动中，且损伤后症状多样，主要表现为肌肉红、肿、热、痛等炎症反应及活动受限等[5-6]。
骨骼肌损伤动物模型复制多以右后肢为研究对象，因为钝挫伤多发生于人体此部分[4，7]。根据损伤严重程度及血肿性质，临床上将骨骼肌损伤分为3级[8-12]：轻度(一级)为少量肌损伤，伴有轻微肿胀，没有或仅有轻微的力量和活动受限；中度(二级)为绝大部分肌纤维损伤，肌肉力量明显下降；重度(三度)损伤范围超过中度，涉及整块肌肉横断面，波及周边其他肌肉组织，损伤后肌肉功能完全丧失，临床研究多以中度损伤为主。
在骨骼肌损伤模型研究中，其重要环节之一为建立或复制实验用动物肌损伤模型，其模型之可行性、适用性及稳定性直接关系到实验后期结果的准确性。骨骼肌钝挫伤模型的研究多以大鼠为实验对象，以兔为实验对象的模型较少，作者认为以兔为实验对象可以更好地观察其宏观及影像学变化，故综合前人骨骼肌钝挫伤模型的制作方法，针对自己的前期实验提出新的骨骼肌打击模型，希望为后续实验者提供参考依据。
国内学者提出，用10 g砝码从1 m处坠落，造成标记处局部软组织损伤，打击点面积为1 cm2，打击后无骨折，无皮肤破裂[13]，此种方法多次被国内学者引用复制软组织损伤[14]。因其打击力度太小(10 g)，坠落点太高(1 m)，易导致打击点偏移，且做功较小(0.1 J)，不易造成骨骼肌损伤。此文在洪汛宁等[15]提出的锤重0.4 kg、底面直径1.5 cm、导向管长30 cm、自由落体高40 cm、同一部位连续打击4次的基础上进行改进，设定打击锤重0.4 kg、底面圆形、直径3.0 cm、自由落体高度分别为75，50，25 cm，在不移动位置的情况下，连续打击4次，对不同高度打击后的骨骼肌损伤程度进行比较。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 于2018年4月至2019年10月在昆明医科大学科研试验中心及昆明医科大学第二附属医院超声科完成。
1.3 材料
1.3.1 动物 普通级、健康、成年、雄性新西兰兔33只，体质量2.5-3.0 kg，由昆明医科大学实验动物学部提供。分笼喂养，自由进食、饮水，室温饲养，湿度(50±5)%，每日自然光照。实验方案经昆明医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号：kmmu2019057。
1.3.2 重物下砸仪 在重物下砸锤下放一圆形直径为4 cm的聚偏氟乙烯管，管两端光滑，管长分别为25，50，75 cm，见图1。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 33只新西兰兔按随机数字表法分为4组，正常组3只，25 cm高度打击组、50 cm高度打击组、75 cm高度打击组各10只。除正常组外均进行不同力度的打击，制备骨骼肌损伤兔模型。
1.4.2 骨骼肌损伤模型制备 兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，待麻醉生效后，将新西兰兔采用侧卧位姿势(右侧在上)固定于造模台，右后肢于伸膝、踝背屈约90°状态，小腿部剃毛，取医用纱布垫于目标肌肉群下起缓冲作用，以避免打击平台接触到动物皮肤。暴露腓肠肌，取腓肠肌距跟骨后缘8 cm左右处做为打击部位并标记，将腓肠肌置于自制重力致伤机下，打击锤重0.4 kg，底面圆形，直径3.0 cm。
模型成功判定标准：①大体观察：砸伤部位皮肤完整、局部肿胀、皮肤青紫、淤血；②砸伤后兔活动减少，伤肢屈曲，行走不利；③解剖病理观察：腓肠肌肿胀充血、无骨折发生，苏木精-伊红色显示肌纤维断裂、肌细胞变性坏死及炎症细胞浸润；④超声影像学显示：无骨折发生。
根据分组分别采用不同高度在不移动位置的情况下连续打击4次。打击后，用25 g/L安尔碘溶液处理创面，1次/d，并保持创面干燥避免感染。
根据重力做功公式可知：
W表示做功，m为打击锤质量，g=9.8 N/kg(1 kg的物体受重力为9.8 N)，h为重力方向上运动的距离(高度)。可计算出不同打击高度所做功及做功总和，见表1。
表1 ｜不同高度打击做功及其总和 (J)Table 1 ｜Blow work and their sum under different heights?
1.4.3 取材 打击后即刻各造模组分别处死3只兔(耳缘静脉注射过量戊巴比妥100 mg/kg)，观察骨折情况、肌肉损伤程度等，快速提取兔右后肢损伤最严重区域腓肠肌组织。将肌肉平均切成2份，用40 g/L多聚甲醛洗净残余血液，将其固定于40 g/L多聚甲醛缓冲液中，脱水后进行常规石蜡制作并切片备用。对剩余实验动物进行超声检查，查看是否骨折；于损伤后3 d各造模组分别处死3只兔，取右后肢损伤最严重区域腓肠肌进行苏木精-伊红染色；50 cm高度打击组进行Masson染色观察肌肉恢复情况。正常组处死1只兔作为对照。
1.5 主要观察指标
1.5.1 测量损伤前后患肢周径 分别在骨骼肌损伤前及损伤后1，3，7，12，24，48，72 h用没有弹性的棉线测量兔腓肠肌损伤处患肢周径并与健侧相同部位对比。
1.5.2 苏木精-伊红染色 将腓肠肌组织从40 g/L多聚甲醛中取出，切成合适大小，放入一次性包埋盒，做好标记，流水冲洗12 h，然后放入自动脱水机中程序脱水、脱蜡，然后包埋制成蜡块。蜡块制成5 μm厚切片，常规脱蜡、至水染色、盐酸酒精分化、透明剂透明、吹干后中性树胶封固。于光学显微镜下观察其正常形态及病理学改变。
1.5.3 Masson染色 取5 μm厚腓肠肌组织切片，脱蜡至水，使用Masson染色试剂盒进行染色：用配置好的Weigert苏木精液染核7 min；酸性分化液分化10 s，水洗；蓝化液蓝化4 min，水洗；蒸馏水洗3次，每次1 min；丽春红品红染液染色8 min；弱酸工作液1 min；磷钼酸溶液洗2 min；弱酸工作液洗1 min；苯胺蓝染色液染色1 min；弱酸工作液洗1 min；体积分数95%乙醇快速脱水；无水乙醇脱水3次，每次7 s；透明剂透明10 min；中性树胶封固。用图像分析软件Image-ProPlus 6.0 分析计算其胶原容积分数，胶原容积分数=同一视野中的胶原面积/所测视野面积。
1.5.4 超声影像学观察 超声学观察采用Siemens Acuson S2000超声诊断仪，14L线阵探头，探头频率14 Hz。实验兔目标区域用8%硫化钠脱毛，范围略大于观察范围。耳缘静脉注射麻药，待麻药生效后将实验兔侧卧与检查台上，充分暴露损伤部位，先检查健侧，再检查患侧，采用直接扫查法进行超声二维成像，通过调整深度和增益获得较为满意的图像，横断加纵断扫查显示图像，观察腓肠肌回声、形态、边界等，并进一步对腓肠肌的具体位置进行定位。
1.6 统计学分析 使用SPSS 23.0软件对资料进行统计分析，首先对多组数据采用Shapiro-Wilk检验以及Levene 检验判断其是否为正态、方差齐否，此次实验数据为正态分布且方差齐，组间比较单因素ANOVA分析，进一步通过Tukey HSD法进行两两比较，检验水准为α=0.05(双侧)。
2 结果 Results
2.1 造模后动物状态 正常组动物无异样；75 cm高度打击组动物活动受限较严重，人为驱赶情况下，1 min移动不超过1 m2；50 cm高度打击组与25 cm高度打击组活动较好，人为驱赶下，1 min内可在9 m2空间内活动。75 cm高度打击组除造模后立即处死3只外，剩余7只仅有2只存活至3 d，1只存活至21 d，将死亡动物进行解剖，发现其均有骨折，见图2。25，50 cm高度打击组动物除正常处死外均存活。
2.2 损伤后患肢周径变化 分别在骨骼肌损伤后1，3，7，12，24，48，72 h用没有弹性的棉线测量腓肠肌损伤处患肢周径，测量结果见表2。对其进行统计发现，75 cm高度打击时12 h右后腿周径达最大，一直持续到72 h；50 cm高度打击于12-24 h后患肢周径达最大，72 h恢复正常，差异有显著性意义；25 cm高度打击患肢周径变化差异无显著性意义(P＞ 0.05)。因75 cm高度打击后动物死亡较多，故不进行比较。
表2 ｜各组兔腓肠肌损伤处患肢周径变化 (n=3，cm)Table 2 ｜Circumference changes of the affected limbs at the injured site of gastrocnemius muscle in rabbits?
2.3 苏木精-伊红染色结果 预实验显示损伤后3 d炎症细胞较多[16]，故此文仅选择损伤后第3天进行比较。正常组肌纤维为多边形，形态较规则，排列紧密，肌细胞核均匀分布于肌膜下，没有增生以及核固缩，肌膜完整性较好，未见水肿，充血，炎性细胞浸润等病理性变化；75 cm高度打击组损伤较严重，故不进行比较；50 cm高度打击组可见大量炎症细胞浸润，血管周围肌纤维溶解并存，部分胞浆被巨噬细胞吞噬；25 cm高度打击炎症反应较轻，见图3。苏木精-伊红结果显示，50 cm高度打击力度可造成软组织中度损伤。
2.4 Masson染色结果 结果表明，相比于75 cm高度打击组和25 cm高度打击组，50 cm高度打击组较为适合，故选择50 cm高度打击组进行研究，观察其损伤后恢复情况。正常肌组织含少量胶原纤维；50 cm高度进行打击，损伤后随时间推移胶原纤维含量逐渐增加，7 d时达高峰，14 d时略下降，21 d时未恢复，见图4。除1 d外，剩余各时点50 cm高度打击组的Masson染色胶原容积分数与正常组相比差异均有显著性意义(P＜ 0.001)，见图5。
2.5 超声影像图结果 兔腓肠肌二维超声检查显示，肌肉长轴切面，正常组兔骨骼肌纹理表现为肌束低回声与肌束膜强回声相间的线状或略网络样排列，沿肌束长轴走行；75 cm高度打击组可见腓骨骨折；50 cm高度打击组可见组织肿胀，腓肠肌厚度增加；25 cm高度打击组腓肠肌肿胀与正常组相比不太明显，见图6。
图1｜自制重物下砸仪Figure 1｜Self-made heavyduty smashing instrument
图2｜不同高度打击后兔患肢解剖图Figure 2｜Anatomical map after blow from different heights图 注：图A为75 cm高度打击组发生骨折；B，C为50 cm高度打击组；D为25 cm高度打击组
图3｜兔腓肠肌苏木精-伊红染色结果(×10)Figure 3｜Hematoxylin-eosin staining of rabbit gastrocnemius muscle(×10)图注：图A为正常组；B为50 cm高度打击组打击损伤后3 d；C为25 cm高度打击组打击损伤后3 d
图4｜兔腓肠肌Masson染色结果(×10)Figure 4｜Masson staining of rabbit gastrocnemius muscle (×10)图注：图A为正常组；B-F为50 cm高度打击组损伤后1，3，7，14，21 d
3 讨论 Discussion
从低等动物到人均存在组织损伤后再生特征，近年来，医学界对骨骼肌损伤后组织再生研究颇多[17-20]，在骨骼肌损伤的实验研究中，建立或复制实验动物损伤模型是研究过程中的首要环节，且其模型的适用性、可靠性和可行性直接关系到后续实验结果的科学性[21-22]。
目前，肌组织损伤模型的类型有肌肉拉伸实验模型、骨骼肌钝挫伤模型、电刺激损伤模型、负荷离心运动、电刺激损伤模型、下坡跑骨骼肌损伤模型及振动负荷试验等[21-27]。其中骨骼肌钝挫伤是钝性暴力直接作用于骨骼肌而引起的急慢性闭合性损伤[28-30]，以下肢、躯干等部位最为多见，亦为临床工作之诊疗重点。故此次研究以新西兰兔为实验对象，建立骨骼肌钝挫伤模型用于骨骼肌钝挫伤后修复治疗等方面的研究，与大鼠、小鼠相比便于损伤后宏观观察及超声影像学分析。
图5｜正常组及50 cm高度打击组兔腓肠肌Masson染色胶原容积分数比较Figure 5｜Collagen volume fraction of rabbit gastrocnemius muscle in the co
ntrol group and 50 cm strike group detected by Masson staining图注：与正常组比较，aP＜ 0.001
图6｜兔腓肠肌二维超声图Figure 6｜Twodimensio
nal ultrasound image of rabbit gastrocnemius muscle图注：图A为正常组；B为75 cm高度打击组，箭头示骨折断端；C为50 cm高度打击组；D为25 cm高度打击组
此次实验从动物整体来看，骨骼肌损伤后实验动物活动受限，损伤局部出现红、肿、热、痛等炎症反应。损伤后腿周径增大，75 cm高度进行打击，72 h后腿周未恢复，且动物死亡较多；50 cm高度打击，动物损伤程度中等，72 h后损伤部位腿周略恢复正常；25 cm高度进行打击后，损伤处出现轻微肿胀，与正常组相比肿胀不明显；故在常规条件下制作骨骼肌损伤模型是50 cm高度进行打击，损伤及恢复相对较适合。苏木精-伊红染色结果显示，损伤3 d后，50 cm高度打击可见大量炎症细胞浸润，血管周围肌纤维溶解并存，部分胞浆被巨噬细胞吞噬；而25 cm高度打击损伤3 d后炎症反应较轻。Massom染色结果显示，50 cm高度进行打击，损伤后7 d胶原纤维含量达峰值，14 d时略下降，21 d时未降至正常。有研究表明，骨骼肌损伤修复过程中，适量胶原纤维沉积利于缩小创面，形成初步纤维连接，增加伤口抗拉伸力以及连接伤口两端肌纤维，促进组织愈合[31-33]。二维超声图显示，75 cm高度进行打击时，腓骨发生骨折；25 cm高度进行打击时腓肠肌肿胀较正常组相比不太明显；50 cm高度进行打击时，既未发生骨折且腓肠肌肿胀明显。
骨骼肌损伤与修复在特殊染色方面应用较少，此次实验采用Masson染色分析其胶原纤维含量占总面积的百分比，因染色和软件分析方面不够熟练可能会存在少许误差。此次实验采用新西兰兔为实验动物，考虑到动物伦理及费用问题，每次取材仅有3只，因此可能会因样本量太小而造成误差。另外75 cm，50 cm和25 cm之间尚有一定活动区间，此次实验为预实验，故未验证更多打击高度。
综上所述，锤重0.4 kg，底面圆形，直径3.0 cm，50 cm高度，固定位置连打4次，可对骨骼肌造成中度损伤，其自然恢复时间大于21 d，适用于兔骨骼肌钝挫伤模型的建立，可为今后兔骨骼肌钝挫伤模型提供参考依据。
4 参考文献 References
[1] KHATTAK MJ, AHMAD T, REHMAN R, et al. Muscle healing and nerve regeneration in a muscle co
ntusion model in the rat. J Bone Joint Surg Br. 2010;92(6):894-899.
[2] GUéNIOT L, LEPERE V, DE MEDEIROS GF, et al. Muscle injury induces postoperative cognitive dysfunction. Sci Rep. 2020;10(1):2768.
[3] J?RVINEN TA, J?RVINEN TL, K??RI?INEN M, et al. Muscle injuries:optimising recovery. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2007;21(2):317-31.
[4] KARY JM. Diagnosis and management of quadriceps strains and contusions. Curr Rev Musculoskelet Med. 2010;3(1-4): 26-31.
[5] SOUZA JD, GOTTFRIED C. Muscle injury: review of experimental models.J Electromyogr Kinesiol. 2013;23(6): 1253-1260.
[6] MORGAN J, PARTRIDGE T. Skeletal muscle in health and disease.Dis Model Mech. 2020;13(2). pii: dmm042192.
[7] PUNTEL GO, CARVALHO NR, AMARAL GP, et al. Therapeutic cold: An effective kind to modulate the oxidative damage resulting of a skeletal muscle contusion. Free Rad Res. 2011;45(2):125-138.
[8] BLANKENBAKER DG, TUITE MJ. Temporal changes of muscle injury.Semin Musculoskelet Radiol. 2010;14(2): 176-193.
[9] HARTMANN DD, GON?ALVES DF, DA ROSA PC, et al. A single muscle co
ntusion promotes an immediate alteration in mitocho
ndrial bioenergetics respo
nse in skeletal muscle fibres with different me
tabolism. Free Radic Res. 2020:1-13.
[10] 张健.黄芪皂甙、丹参酮ⅡA对大鼠骨骼肌急性钝挫伤疗效的观察[D].上海:复旦大学,2010.
[11] LANGER HT, AFZAL S, KEMPA S. Nerve damage induced skeletal muscle atrophy is associated with increased accumulation of intramuscular glucose and polyol pathway intermediates. Sci Rep. 2020;10(1):1908.
[12] NAKANISHI T, TSUJII M, ASANO T, et al. Protective effect of edaravone against oxidative stress in c2c12 myoblast and impairment of skeletal muscle regeneration exposed to ischemic injury in ob/ob mice.Front Physiol. 2020;10:1596.
[13] 朱利敏,何忠平,朱欣,等.软组织损伤兔模型的复制[J].上海实验动物科学,1999,19(4):28-29.
[14] 向勇,王春林,董有康,等.柔和手法对兔骨骼肌慢性损伤修复过程中生长因子的影响[J].河南中医,2018,38(7):1016-1019.
[15] 洪汛宁,王德杭,王小宁,等.肌肉损伤磁共振成像的病理基础研究[J].南京医科大学学报,2000,20(5):362-364
[16] 刘杏,魏晓菡,李仲铭,等.白藜芦醇上调碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1表达治疗骨骼肌损伤[J].中国组织工程研究,2020,24(14):2184-2191.
[17] BAGHDADI MB, TAJBAKHSH S. Regulation and phylogeny of skeletal muscle regeneration.Dev Biol. 2018;433(2): 200-209.
[18] WON YH, CHO YS, KIM DH, et al. Relation between low pulmo
nary function and skeletal muscle index in burn patients with major burn injury and smoke inhalation: a retrospective study. J Burn Care Res.2020. pii: iraa015.
[19] CUNNINGHAM RJ, LORAM ID. Estimation of absolute states of human skeletal muscle via standard B-mode ultrasound imaging and deep co
nvolutional neural networks. J R Soc Interface.2020;17(162):20190715.
[20] SU WH, WANG CJ, HUNG YY, et al. MicroRNA-29a exhibited proangiogenic and anti-fibrotic features to intensify human umbilical cord mesenchymal stem cells-renovated perfusion recovery and preventing against fibrosis from skeletal muscle ischemic injury.Int J Mol Sci.2019;20(23). pii: E5859.
[21] 孙茹.骨骼肌损伤与修复过程中炎症反应与肌卫星细胞再生关系的研究[D].长春:东北师范大学,2009.
[22] POURGHADAMYARI H,REZAEI M,IPAKCHI-AZIMI A,et al. Establishing a new animal model for muscle regeneration studies. Mol Biol Res Commun. 2019;8(4):171-179.
[23] 杨宁,周越,王瑞元,等.针刺对骨骼肌拉伤恢复进程中纤维化因子的影响[J].北京体育大学学报,2018,41(9):70-74+82.
[24] 刘晓光,陈佩杰,赵淋淋,等.骨骼肌挫伤修复过程中巨噬细胞的趋化机制[J].上海体育学院学报,2019,43(4):92-98.
[25] 黄于婷. 电针对大鼠颈肌慢性损伤模型肌卫星细胞及TLR4/ MyD88/NF-κB通路的影响[D].福州:福建中医药大学,2019.
[26] 冯其明.β-丙氨酸摄入干预对下坡跑运动诱发的肌肉损伤的影响[J].基因组学与应用生物学,2018,37(10):4639-4646.
[27] 解霜雁,林立,邵华.振动对家兔骨骼肌线粒体呼吸链酶及ATP酶活力的影响[J].济宁医学院学报,2019,42(1):15-18+23.
[28] 张海平,宋吉锐.急性骨骼肌损伤动物实验模型构建及应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,10(49):9984-9988.
[29] RUSS DW, GARVEY SM, DENSMORE C, et al. Effect of acute muscle co
ntusion injury, with and without dietary fish oil, on adult and aged male rats: co
ntractile and biochemical responses. Exp Gerontol. 2018;111:241-252.
[30] LUO A, TANG CL, HUANG SQ, et al.Changes in ex
pression of autophagyrelated factors during acute co
ntusion repair of skeletal muscle.Zho
ngguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2018;34(2):97-101.
[31] HURME T, KALIMO H, SANDBERG M, et al. Localization of type I and III collagen and fibro
nectin production in injured gastrocnemius muscle.Lab Invest. 1991; 64(1): 76-84.
[32] CHEN YP, LIU T, XU Y, et al. Effect of electroacupuncture at “Weizhong”(BL40) on ex
pression of collagen I and matrix me
ta-lloproteinases 2 in rats with lumbar multifidus muscle injury. Zhen Ci Yan Jiu. 2019;44(5):341-346.
[33] MAHDY MAA. Skeletal muscle fibrosis: an overview. Cell Tissue Res.2019;375(3):575-588.
0 引言 Introduction骨骼肌钝挫伤是最常见的肌肉损伤类型之一[1-2]，指发生在组织受到快速而强大的压力，如直接且非穿透性撞击肌腹的情况下，通常会导致肌肉的钝挫伤，进而导致肌肉内血肿[3-4]。这类损伤多发生于足球等团队运动中，且损伤后症状多样，主要表现为肌肉红、肿、热、痛等炎症反应及活动受限等[5-6]。骨骼肌损伤动物模型复制多以右后肢为研究对象，因为钝挫伤多发生于人体此部分[4，7]。根据损伤严重程度及血肿性质，临床上将骨骼肌损伤分为3级[8-12]：轻度(一级)为少量肌损伤，伴有轻微肿胀，没有或仅有轻微的力量和活动受限；中度(二级)为绝大部分肌纤维损伤，肌肉力量明显下降；重度(三度)损伤范围超过中度，涉及整块肌肉横断面，波及周边其他肌肉组织，损伤后肌肉功能完全丧失，临床研究多以中度损伤为主。在骨骼肌损伤模型研究中，其重要环节之一为建立或复制实验用动物肌损伤模型，其模型之可行性、适用性及稳定性直接关系到实验后期结果的准确性。骨骼肌钝挫伤模型的研究多以大鼠为实验对象，以兔为实验对象的模型较少，作者认为以兔为实验对象可以更好地观察其宏观及影像学变化，故综合前人骨骼肌钝挫伤模型的制作方法，针对自己的前期实验提出新的骨骼肌打击模型，希望为后续实验者提供参考依据。国内学者提出，用10 g砝码从1 m处坠落，造成标记处局部软组织损伤，打击点面积为1 cm2，打击后无骨折，无皮肤破裂[13]，此种方法多次被国内学者引用复制软组织损伤[14]。因其打击力度太小(10 g)，坠落点太高(1 m)，易导致打击点偏移，且做功较小(0.1 J)，不易造成骨骼肌损伤。此文在洪汛宁等[15]提出的锤重0.4 kg、底面直径1.5 cm、导向管长30 cm、自由落体高40 cm、同一部位连续打击4次的基础上进行改进，设定打击锤重0.4 kg、底面圆形、直径3.0 cm、自由落体高度分别为75，50，25 cm，在不移动位置的情况下，连续打击4次，对不同高度打击后的骨骼肌损伤程度进行比较。1 材料和方法 Materials and methods1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 于2018年4月至2019年10月在昆明医科大学科研试验中心及昆明医科大学第二附属医院超声科完成。1.3 材料1.3.1 动物 普通级、健康、成年、雄性新西兰兔33只，体质量2.5-3.0 kg，由昆明医科大学实验动物学部提供。分笼喂养，自由进食、饮水，室温饲养，湿度(50±5)%，每日自然光照。实验方案经昆明医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号：kmmu2019057。1.3.2 重物下砸仪 在重物下砸锤下放一圆形直径为4 cm的聚偏氟乙烯管，管两端光滑，管长分别为25，50，75 cm，见图1。1.4 实验方法1.4.1 动物分组 33只新西兰兔按随机数字表法分为4组，正常组3只，25 cm高度打击组、50 cm高度打击组、75 cm高度打击组各10只。除正常组外均进行不同力度的打击，制备骨骼肌损伤兔模型。1.4.2 骨骼肌损伤模型制备 兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，待麻醉生效后，将新西兰兔采用侧卧位姿势(右侧在上)固定于造模台，右后肢于伸膝、踝背屈约90°状态，小腿部剃毛，取医用纱布垫于目标肌肉群下起缓冲作用，以避免打击平台接触到动物皮肤。暴露腓肠肌，取腓肠肌距跟骨后缘8 cm左右处做为打击部位并标记，将腓肠肌置于自制重力致伤机下，打击锤重0.4 kg，底面圆形，直径3.0 cm。模型成功判定标准：①大体观察：砸伤部位皮肤完整、局部肿胀、皮肤青紫、淤血；②砸伤后兔活动减少，伤肢屈曲，行走不利；③解剖病理观察：腓肠肌肿胀充血、无骨折发生，苏木精-伊红色显示肌纤维断裂、肌细胞变性坏死及炎症细胞浸润；④超声影像学显示：无骨折发生。根据分组分别采用不同高度在不移动位置的情况下连续打击4次。打击后，用25 g/L安尔碘溶液处理创面，1次/d，并保持创面干燥避免感染。根据重力做功公式可知：W表示做功，m为打击锤质量，g=9.8 N/kg(1 kg的物体受重力为9.8 N)，h为重力方向上运动的距离(高度)。可计算出不同打击高度所做功及做功总和，见表1。表1 ｜不同高度打击做功及其总和 (J)Table 1 ｜Blow work and their sum under different heights?1.4.3 取材 打击后即刻各造模组分别处死3只兔(耳缘静脉注射过量戊巴比妥100 mg/kg)，观察骨折情况、肌肉损伤程度等，快速提取兔右后肢损伤最严重区域腓肠肌组织。将肌肉平均切成2份，用40 g/L多聚甲醛洗净残余血液，将其固定于40 g/L多聚甲醛缓冲液中，脱水后进行常规石蜡制作并切片备用。对剩余实验动物进行超声检查，查看是否骨折；于损伤后3 d各造模组分别处死3只兔，取右后肢损伤最严重区域腓肠肌进行苏木精-伊红染色；50 cm高度打击组进行Masson染色观察肌肉恢复情况。正常组处死1只兔作为对照。1.5 主要观察指标1.5.1 测量损伤前后患肢周径 分别在骨骼肌损伤前及损伤后1，3，7，12，24，48，72 h用没有弹性的棉线测量兔腓肠肌损伤处患肢周径并与健侧相同部位对比。1.5.2 苏木精-伊红染色 将腓肠肌组织从40 g/L多聚甲醛中取出，切成合适大小，放入一次性包埋盒，做好标记，流水冲洗12 h，然后放入自动脱水机中程序脱水、脱蜡，然后包埋制成蜡块。蜡块制成5 μm厚切片，常规脱蜡、至水染色、盐酸酒精分化、透明剂透明、吹干后中性树胶封固。于光学显微镜下观察其正常形态及病理学改变。1.5.3 Masson染色 取5 μm厚腓肠肌组织切片，脱蜡至水，使用Masson染色试剂盒进行染色：用配置好的Weigert苏木精液染核7 min；酸性分化液分化10 s，水洗；蓝化液蓝化4 min，水洗；蒸馏水洗3次，每次1 min；丽春红品红染液染色8 min；弱酸工作液1 min；磷钼酸溶液洗2 min；弱酸工作液洗1 min；苯胺蓝染色液染色1 min；弱酸工作液洗1 min；体积分数95%乙醇快速脱水；无水乙醇脱水3次，每次7 s；透明剂透明10 min；中性树胶封固。用图像分析软件Image-ProPlus 6.0 分析计算其胶原容积分数，胶原容积分数=同一视野中的胶原面积/所测视野面积。1.5.4 超声影像学观察 超声学观察采用Siemens Acuson S2000超声诊断仪，14L线阵探头，探头频率14 Hz。实验兔目标区域用8%硫化钠脱毛，范围略大于观察范围。耳缘静脉注射麻药，待麻药生效后将实验兔侧卧与检查台上，充分暴露损伤部位，先检查健侧，再检查患侧，采用直接扫查法进行超声二维成像，通过调整深度和增益获得较为满意的图像，横断加纵断扫查显示图像，观察腓肠肌回声、形态、边界等，并进一步对腓肠肌的具体位置进行定位。1.6 统计学分析 使用SPSS 23.0软件对资料进行统计分析，首先对多组数据采用Shapiro-Wilk检验以及Levene 检验判断其是否为正态、方差齐否，此次实验数据为正态分布且方差齐，组间比较单因素ANOVA分析，进一步通过Tukey HSD法进行两两比较，检验水准为α=0.05(双侧)。2 结果 Results2.1 造模后动物状态 正常组动物无异样；75 cm高度打击组动物活动受限较严重，人为驱赶情况下，1 min移动不超过1 m2；50 cm高度打击组与25 cm高度打击组活动较好，人为驱赶下，1 min内可在9 m2空间内活动。75 cm高度打击组除造模后立即处死3只外，剩余7只仅有2只存活至3 d，1只存活至21 d，将死亡动物进行解剖，发现其均有骨折，见图2。25，50 cm高度打击组动物除正常处死外均存活。2.2 损伤后患肢周径变化 分别在骨骼肌损伤后1，3，7，12，24，48，72 h用没有弹性的棉线测量腓肠肌损伤处患肢周径，测量结果见表2。对其进行统计发现，75 cm高度打击时12 h右后腿周径达最大，一直持续到72 h；50 cm高度打击于12-24 h后患肢周径达最大，72 h恢复正常，差异有显著性意义；25 cm高度打击患肢周径变化差异无显著性意义(P＞ 0.05)。因75 cm高度打击后动物死亡较多，故不进行比较。表2 ｜各组兔腓肠肌损伤处患肢周径变化 (n=3，cm)Table 2 ｜Circumference changes of the affected limbs at the injured site of gastrocnemius muscle in rabbits?2.3 苏木精-伊红染色结果 预实验显示损伤后3 d炎症细胞较多[16]，故此文仅选择损伤后第3天进行比较。正常组肌纤维为多边形，形态较规则，排列紧密，肌细胞核均匀分布于肌膜下，没有增生以及核固缩，肌膜完整性较好，未见水肿，充血，炎性细胞浸润等病理性变化；75 cm高度打击组损伤较严重，故不进行比较；50 cm高度打击组可见大量炎症细胞浸润，血管周围肌纤维溶解并存，部分胞浆被巨噬细胞吞噬；25 cm高度打击炎症反应较轻，见图3。苏木精-伊红结果显示，50 cm高度打击力度可造成软组织中度损伤。2.4 Masson染色结果 结果表明，相比于75 cm高度打击组和25 cm高度打击组，50 cm高度打击组较为适合，故选择50 cm高度打击组进行研究，观察其损伤后恢复情况。正常肌组织含少量胶原纤维；50 cm高度进行打击，损伤后随时间推移胶原纤维含量逐渐增加，7 d时达高峰，14 d时略下降，21 d时未恢复，见图4。除1 d外，剩余各时点50 cm高度打击组的Masson染色胶原容积分数与正常组相比差异均有显著性意义(P＜ 0.001)，见图5。2.5 超声影像图结果 兔腓肠肌二维超声检查显示，肌肉长轴切面，正常组兔骨骼肌纹理表现为肌束低回声与肌束膜强回声相间的线状或略网络样排列，沿肌束长轴走行；75 cm高度打击组可见腓骨骨折；50 cm高度打击组可见组织肿胀，腓肠肌厚度增加；25 cm高度打击组腓肠肌肿胀与正常组相比不太明显，见图6。图1｜自制重物下砸仪Figure 1｜Self-made heavyduty smashing instrument图2｜不同高度打击后兔患肢解剖图Figure 2｜Anatomical map after blow from different heights图 注：图A为75 cm高度打击组发生骨折；B，C为50 cm高度打击组；D为25 cm高度打击组图3｜兔腓肠肌苏木精-伊红染色结果(×10)Figure 3｜Hematoxylin-eosin staining of rabbit gastrocnemius muscle(×10)图注：图A为正常组；B为50 cm高度打击组打击损伤后3 d；C为25 cm高度打击组打击损伤后3 d图4｜兔腓肠肌Masson染色结果(×10)Figure 4｜Masson staining of rabbit gastrocnemius muscle (×10)图注：图A为正常组；B-F为50 cm高度打击组损伤后1，3，7，14，21 d3 讨论 Discussion从低等动物到人均存在组织损伤后再生特征，近年来，医学界对骨骼肌损伤后组织再生研究颇多[17-20]，在骨骼肌损伤的实验研究中，建立或复制实验动物损伤模型是研究过程中的首要环节，且其模型的适用性、可靠性和可行性直接关系到后续实验结果的科学性[21-22]。目前，肌组织损伤模型的类型有肌肉拉伸实验模型、骨骼肌钝挫伤模型、电刺激损伤模型、负荷离心运动、电刺激损伤模型、下坡跑骨骼肌损伤模型及振动负荷试验等[21-27]。其中骨骼肌钝挫伤是钝性暴力直接作用于骨骼肌而引起的急慢性闭合性损伤[28-30]，以下肢、躯干等部位最为多见，亦为临床工作之诊疗重点。故此次研究以新西兰兔为实验对象，建立骨骼肌钝挫伤模型用于骨骼肌钝挫伤后修复治疗等方面的研究，与大鼠、小鼠相比便于损伤后宏观观察及超声影像学分析。图5｜正常组及50 cm高度打击组兔腓肠肌Masson染色胶原容积分数比较Figure 5｜Collagen volume fraction of rabbit gastrocnemius muscle in the co
ntrol group and 50 cm strike group detected by Masson staining图注：与正常组比较，aP＜ 0.001图6｜兔腓肠肌二维超声图Figure 6｜Twodimensio
nal ultrasound image of rabbit gastrocnemius muscle图注：图A为正常组；B为75 cm高度打击组，箭头示骨折断端；C为50 cm高度打击组；D为25 cm高度打击组此次实验从动物整体来看，骨骼肌损伤后实验动物活动受限，损伤局部出现红、肿、热、痛等炎症反应。损伤后腿周径增大，75 cm高度进行打击，72 h后腿周未恢复，且动物死亡较多；50 cm高度打击，动物损伤程度中等，72 h后损伤部位腿周略恢复正常；25 cm高度进行打击后，损伤处出现轻微肿胀，与正常组相比肿胀不明显；故在常规条件下制作骨骼肌损伤模型是50 cm高度进行打击，损伤及恢复相对较适合。苏木精-伊红染色结果显示，损伤3 d后，50 cm高度打击可见大量炎症细胞浸润，血管周围肌纤维溶解并存，部分胞浆被巨噬细胞吞噬；而25 cm高度打击损伤3 d后炎症反应较轻。Massom染色结果显示，50 cm高度进行打击，损伤后7 d胶原纤维含量达峰值，14 d时略下降，21 d时未降至正常。有研究表明，骨骼肌损伤修复过程中，适量胶原纤维沉积利于缩小创面，形成初步纤维连接，增加伤口抗拉伸力以及连接伤口两端肌纤维，促进组织愈合[31-33]。二维超声图显示，75 cm高度进行打击时，腓骨发生骨折；25 cm高度进行打击时腓肠肌肿胀较正常组相比不太明显；50 cm高度进行打击时，既未发生骨折且腓肠肌肿胀明显。骨骼肌损伤与修复在特殊染色方面应用较少，此次实验采用Masson染色分析其胶原纤维含量占总面积的百分比，因染色和软件分析方面不够熟练可能会存在少许误差。此次实验采用新西兰兔为实验动物，考虑到动物伦理及费用问题，每次取材仅有3只，因此可能会因样本量太小而造成误差。另外75 cm，50 cm和25 cm之间尚有一定活动区间，此次实验为预实验，故未验证更多打击高度。综上所述，锤重0.4 kg，底面圆形，直径3.0 cm，50 cm高度，固定位置连打4次，可对骨骼肌造成中度损伤，其自然恢复时间大于21 d，适用于兔骨骼肌钝挫伤模型的建立，可为今后兔骨骼肌钝挫伤模型提供参考依据。4 参考文献 References[1] KHATTAK MJ, AHMAD T, REHMAN R, et al. Muscle healing and nerve regeneration in a muscle co
ntusion model in the rat. J Bone Joint Surg Br. 2010;92(6):894-899.[2] GUéNIOT L, LEPERE V, DE MEDEIROS GF, et al. Muscle injury induces postoperative cognitive dysfunction. Sci Rep. 2020;10(1):2768.[3] J?RVINEN TA, J?RVINEN TL, K??RI?INEN M, et al. Muscle injuries:optimising recovery. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2007;21(2):317-31.[4] KARY JM. Diagnosis and management of quadriceps strains and contusions. Curr Rev Musculoskelet Med. 2010;3(1-4): 26-31.[5] SOUZA JD, GOTTFRIED C. Muscle injury: review of experimental models.J Electromyogr Kinesiol. 2013;23(6): 1253-1260.[6] MORGAN J, PARTRIDGE T. Skeletal muscle in health and disease.Dis Model Mech. 2020;13(2). pii: dmm042192.[7] PUNTEL GO, CARVALHO NR, AMARAL GP, et al. Therapeutic cold: An effective kind to modulate the oxidative damage resulting of a skeletal muscle contusion. Free Rad Res. 2011;45(2):125-138.[8] BLANKENBAKER DG, TUITE MJ. Temporal changes of muscle injury.Semin Musculoskelet Radiol. 2010;14(2): 176-193.[9] HARTMANN DD, GON?ALVES DF, DA ROSA PC, et al. A single muscle co
ntusion promotes an immediate alteration in mitocho
ndrial bioenergetics respo
nse in skeletal muscle fibres with different me
tabolism. Free Radic Res. 2020:1-13.[10] 张健.黄芪皂甙、丹参酮ⅡA对大鼠骨骼肌急性钝挫伤疗效的观察[D].上海:复旦大学,2010.[11] LANGER HT, AFZAL S, KEMPA S. Nerve damage induced skeletal muscle atrophy is associated with increased accumulation of intramuscular glucose and polyol pathway intermediates. Sci Rep. 2020;10(1):1908.[12] NAKANISHI T, TSUJII M, ASANO T, et al. Protective effect of edaravone against oxidative stress in c2c12 myoblast and impairment of skeletal muscle regeneration exposed to ischemic injury in ob/ob mice.Front Physiol. 2020;10:1596.[13] 朱利敏,何忠平,朱欣,等.软组织损伤兔模型的复制[J].上海实验动物科学,1999,19(4):28-29.[14] 向勇,王春林,董有康,等.柔和手法对兔骨骼肌慢性损伤修复过程中生长因子的影响[J].河南中医,2018,38(7):1016-1019.[15] 洪汛宁,王德杭,王小宁,等.肌肉损伤磁共振成像的病理基础研究[J].南京医科大学学报,2000,20(5):362-364[16] 刘杏,魏晓菡,李仲铭,等.白藜芦醇上调碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1表达治疗骨骼肌损伤[J].中国组织工程研究,2020,24(14):2184-2191.[17] BAGHDADI MB, TAJBAKHSH S. Regulation and phylogeny of skeletal muscle regeneration.Dev Biol. 2018;433(2): 200-209.[18] WON YH, CHO YS, KIM DH, et al. Relation between low pulmo
nary function and skeletal muscle index in burn patients with major burn injury and smoke inhalation: a retrospective study. J Burn Care Res.2020. pii: iraa015.[19] CUNNINGHAM RJ, LORAM ID. Estimation of absolute states of human skeletal muscle via standard B-mode ultrasound imaging and deep co
nvolutional neural networks. J R Soc Interface.2020;17(162):20190715.[20] SU WH, WANG CJ, HUNG YY, et al. MicroRNA-29a exhibited proangiogenic and anti-fibrotic features to intensify human umbilical cord mesenchymal stem cells-renovated perfusion recovery and preventing against fibrosis from skeletal muscle ischemic injury.Int J Mol Sci.2019;20(23). pii: E5859.[21] 孙茹.骨骼肌损伤与修复过程中炎症反应与肌卫星细胞再生关系的研究[D].长春:东北师范大学,2009.[22] POURGHADAMYARI H,REZAEI M,IPAKCHI-AZIMI A,et al. Establishing a new animal model for muscle regeneration studies. Mol Biol Res Commun. 2019;8(4):171-179.[23] 杨宁,周越,王瑞元,等.针刺对骨骼肌拉伤恢复进程中纤维化因子的影响[J].北京体育大学学报,2018,41(9):70-74+82.[24] 刘晓光,陈佩杰,赵淋淋,等.骨骼肌挫伤修复过程中巨噬细胞的趋化机制[J].上海体育学院学报,2019,43(4):92-98.[25] 黄于婷. 电针对大鼠颈肌慢性损伤模型肌卫星细胞及TLR4/ MyD88/NF-κB通路的影响[D].福州:福建中医药大学,2019.[26] 冯其明.β-丙氨酸摄入干预对下坡跑运动诱发的肌肉损伤的影响[J].基因组学与应用生物学,2018,37(10):4639-4646.[27] 解霜雁,林立,邵华.振动对家兔骨骼肌线粒体呼吸链酶及ATP酶活力的影响[J].济宁医学院学报,2019,42(1):15-18+23.[28] 张海平,宋吉锐.急性骨骼肌损伤动物实验模型构建及应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,10(49):9984-9988.[29] RUSS DW, GARVEY SM, DENSMORE C, et al. Effect of acute muscle co
ntusion injury, with and without dietary fish oil, on adult and aged male rats: co
ntractile and biochemical responses. Exp Gerontol. 2018;111:241-252.[30] LUO A, TANG CL, HUANG SQ, et al.Changes in ex
pression of autophagyrelated factors during acute co
ntusion repair of skeletal muscle.Zho
ngguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2018;34(2):97-101.[31] HURME T, KALIMO H, SANDBERG M, et al. Localization of type I and III collagen and fibro
nectin production in injured gastrocnemius muscle.Lab Invest. 1991; 64(1): 76-84.[32] CHEN YP, LIU T, XU Y, et al. Effect of electroacupuncture at “Weizhong”(BL40) on ex
pression of collagen I and matrix me
ta-lloproteinases 2 in rats with lumbar multifidus muscle injury. Zhen Ci Yan Jiu. 2019;44(5):341-346.[33] MAHDY MAA. Skeletal muscle fibrosis: an overview. Cell Tissue Res.2019;375(3):575-588.
文章来源：现代医用影像学 网址: http://xdyyyxx.400nongye.com/lunwen/itemid-2500.shtml
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